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熒光雙重染色試劑盒

貨號:G1225

品牌:Servicebio

價格:¥3000

規格:

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  產品簡介:

  該試劑盒適用于石蠟切片免疫熒光雙重染色,既可用于相同來源抗體的雙染, 也可用于不同來源抗體的雙染。其主要原理是利用酪酰胺信號放大(TSA)技術, 在 HRP 的作用下,熒光素標記的信號增強劑在能夠與抗原結合,通過微波處理去除結合的一抗二抗,但不會影響熒光素標記的增強劑與抗原的結合,因此不會 與后加入的一抗二抗發生交叉反應,從根本上解決了熒光同源雙標串色的問題。此外還能夠放大陽性信號,提高低豐度蛋白的檢測效果。

  包裝內容:

產品貨號 產品名稱 規格
G1225-1 A 液:信號增強劑(FITC 標記) 50μL
G1225-2 B 液:信號增強劑(CY3 標記) 50μL
G1225-3 C 液:稀釋液 20ml
G1225-4 D 液:封閉液 1 20ml
G1225-5 E 液:封閉液 2 20ml
G1225-6 F 液:DAPI 20ml
G1225-7 G 液:自發熒光淬滅劑 20ml
G1225-8 H 液:抗熒光淬滅封片劑 20ml

  保存條件:

  整套試劑 4℃避光保存,有效期 3 個月。

  客戶自備試劑:

  1.0.01mol/L pH7.4 的 PBS 緩沖液。

  2.HRP 標記二抗(同源雙標一個二抗,異源雙標相同來源的兩個二抗)。

  使用方法:

  第一抗體孵育:

  1.脫蠟、水化組織切片;

  2.根據所應用的一抗的特殊要求,對組織切片進行抗原修復;

  3.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘

  4.加入 100μL D 液孵育 10 分鐘,阻斷內源性過氧化物酶,以減少非特異性背景染色;

  5.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘,組化筆畫圈;

  6.加入 100μL E 液孵育 30 分鐘來減少非特異性染色(血清封閉);

  7.甩掉 E 液,加第一個一抗(一抗濃度按照抗體說明書建議濃度降低 5-10 倍配制,配制好的一抗工作液置于離心機中 12000 轉離心 5 分鐘,滴加一抗時, 吸取上層的,底部的 30μL 舍棄不用),避光濕盒 4℃過夜孵育;

  8.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  9.加入配制的 HRP 標記二抗(針對第一個一抗),室溫孵育 50 分鐘;

  10.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  11.加入 100 μL 用 C 液稀釋的信號增強劑 A 或者 B 工作液(A 液或 B 液:C 液=1:500。 配制好的信號增強劑工作液,至于 12000 轉離心 5 分鐘,吸取上層的,底部 30 μL 舍棄不用),避光濕盒室溫孵育 10 分鐘;

  12.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  第二抗體孵育:

  1.超純水洗 2 次,每次 5 分鐘;

  2.將切片放入盛有抗原修復液的修復盒內進行微波處理,維持 95℃以上溫度15 分鐘,自然冷卻至室溫;

  3.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  4.加入 100μL E 液孵育 10 分鐘;

  5.甩掉 E 液,加第二個一抗(一抗濃度按照抗體說明書建議濃度降低 5-10 倍配制,配制好的一抗工作液置于離心機中 12000 轉離心 5 分鐘,滴加一抗時, 吸取上層的,底部的 30μL 舍棄不用),避光濕盒 4℃過夜孵育;

  6.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  7.加入配制的 HRP 標記二抗(針對第二抗體的),室溫孵育 50 分鐘;

  8.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  9.加入 100μL 用 C 液稀釋的信號增強劑 B 或者 A 工作液(A 液或 B 液:C 液=1:500。 配制好的信號增強劑工作液,至于 12000 轉離心 5 分鐘,吸取上層的,底部 30 μL 舍棄不用)室溫孵育 10 分鐘;

  10.PBS 洗 3 次,每次 5 分鐘;

  11.加入 100μL F 液 DAPI 染核,室溫孵育 5 分鐘;

  12.超純水沖洗,加入 100μL G 液,孵育 5 分鐘,淬滅組織自發熒光;

  13.流水沖洗 20 分鐘(勿正對組織);

  14.滴加 100μL H 液,50mm×50mm 蓋玻片封片。

  注意事項:

  1.實驗操作應避光進行(暗環境);

  2.PBS洗滌要充分,減少非特異性著色;

  3.一抗濃度按說明書推薦濃度降低5-10倍稀釋;

  4.實驗操作過程中避免組織干片;

  5.試劑現配現用。

  常見問題及解決方案:

分類 可能原因 優化方案
 
無陽性信號
抗體效價低 安排對照實驗,確認一抗二抗效果
抗原修復偏弱 提高抗原修復強度
 
 
陽性信號弱
抗體濃度低 提高一抗濃度
抗原修復偏弱 提高抗原修復強度
增強劑孵育時間短 延長增強劑的孵育時間
 
 
非特異性著色多
抗體濃度過高 降低抗體濃度
增強劑孵育時間過長 縮短增強劑的孵育時間
封閉效果不佳 延長試劑D,E 的孵育時間

  圖例:

大鼠腦 NEUN(綠光)+MBP(紅光)

H 睪丸癌 CD68(綠光)+CD8(紅光)

大鼠腦 GFAP(綠光)+NEUN(紅光)

H 腎 α-SMA(綠光)+CD31(紅光)

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